ABRA在大鼠中枢神经系统中的表达及其对神经元突起生长作用的初步研究

【摘要】第一部分ABRA在大鼠中枢神经系统的分布及定位’目的：观察肌动蛋白结合蛋白ABRA(actin-bindingrho-activatingprotein)在成年大鼠大脑皮质、海马区、基底节区、小脑、脊髓的表达。探讨这种新发现的肌动蛋白结合蛋白在中枢神经系统中的可能作用及意义。方法：制备成年大鼠大脑皮质、海马区、基底节区、小脑、脊髓的冰冻切片,采用共聚焦免疫荧光组织化学技术检测ABRA在大鼠大脑皮质、海马区、基底节区、小脑、脊髓的表达定位。分别采用RT-PCR、westernblot检测海马中ABRAmRNA及ABRA蛋白水平的表达。结果：(1)ABRA表达在大鼠中枢神经系统神经元的胞核、胞浆和突起,其中胞核着色最强；(2)在大脑皮质,ABRA阳性神经元胞体和突起广泛分布于皮质的分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层、多形细胞层；(3)在海马区,ABRA均匀分布于海马各部,阳性神经元集中于锥体细胞层,而其阳性突起弥散分布于海马分子层和多形层；(4)在基底节区,ABRA阳性产物广泛表达于神经元胞体和突起；(5)在小脑,ABRA阳性神经元胞体分布于浦肯野细胞层及颗粒层,其阳性突起分布于分子层；(6)在脊髓,ABRA阳性产物表达在整个灰质和白质；(7)ABRA与F-actin免疫荧光共定位研究显示ABRA与F-actin在神经元的胞浆和突起共定位。但在海马区,ABRA与F-actin仅在神经元的突起共定位,在神经元胞体没有共定位。(8)RT-PCR与westernblot检测到海马中分别有ABRAmRNA和蛋白的表达。结论：我们的实验首次证实了ABRA在大鼠大脑皮质、海马区、基底节区、小脑、脊髓有广泛表达,提示ABRA可能在大鼠这些部位的神经细胞功能活动方面起重要作用。第二部分ABRA在不同年龄阶段大鼠大脑皮质、海马、脊髓中的表达变化目的：检测ABRA在不同年龄阶段大鼠大脑皮质、海马、脊髓中的表达变化,从而探讨ABRA在中枢神经系统发育过程中的可能作用及意义。方法：不同年龄阶段正常SD大鼠36只,雄雌各半,新生鼠(生后7天,n=12)、成年鼠(6月龄,n=12)、老年鼠(20月龄,n＝12)。采用westernblot定量检测不同年龄阶段大鼠大脑皮质、海马、脊髓中ABRA蛋白水平表达变化以及采用免疫荧光组织化学染色检测上述部位ABRA细胞定位。结果：(1)不同年龄阶段大鼠大脑皮质和海马中均检测到ABRA的表达,在新生期,ABRA蛋白水平表达较高,主要表达在胞浆和胞核；成年期,ABRA蛋白水平较新生期下降,除在胞浆与胞核内表达外,在细胞的突起也有强表达；在老年期,ABRA蛋白及表达ABRA的细胞均显著下降。(2)不同年龄阶段大鼠脊髓中均检测到ABRA的表达。Westernblot显示ABRA在新生鼠脊髓中表达显著高于成年鼠及老年鼠。免疫荧光染色显示ABRA广泛表达于神经元的胞核、胞浆和突起,在脊髓前角,与前角运动神经元存在共定位,在脊髓后角,与小的NeuN阳性感觉神经元存在共定位。同时,免疫荧光双标结果显示,在新生鼠,脊髓前角、后角的ABRA与NeuN双阳性细胞计数占总ABRA阳性细胞百分比显著低于成年鼠及老年鼠。结论：我们的实验检测了ABRA在不同年龄阶段大鼠中枢神经系统的表达变化。ABRA在中枢神经系统表达及随发育时段而变化的事实提示ABRA可能参与中枢神经系统的发育成熟、突触的形成以及可塑性调节过程。第三部分shRNA干扰ABRA对大鼠原代培养海马神经元突起生长的影响目的：检测ABRA在原代培养海马神经元的表达定位,并采用构建好的RNAi质粒载体通过Lipofectamine2000转染培养的原代海马神经元,检测针对ABRA不同靶位点的RNAi对神经元细胞ABRA基因表达的影响,筛选出具有最佳抑制效应的shRNA转染神经元细胞,抑制ABRA基因表达,研究分析ABRA在神经元突起生长与细胞骨架改变过程中所起的作用。方法：分离、培养大鼠海马神经元,观察其生长和形态结构,采用MAP-2荧光标记鉴定神经元的纯度。采用免疫组织化学检测ABRA在培养的海马神经元细胞中的表达分布。采用Lipofectamine2000转染培养的海马神经元,通过RT-PCR、westernblot、免疫荧光筛选干扰ABRAmRNA表达的shRNA,选择抑制作用最明显的5’端标记GFP绿色荧光基团的shRNA转染神经元细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光在神经元内的表达部位及神经元突起生长情况。结果：(1)原代培养的海马神经元纯度达90%。(2)ABRA主要表达在神经细胞的胞体、树突和轴突中,胞体内尤为丰富,与MAP-2共定位在树突中。(3)各组神经元转染率分别为23.2%(shNC)、22.4%(shABRA-57)、29.3%(shABRA-371)、22.8%(shABRA-944)、24.6%(shABRA-1015)和23.5%(shGAPDH),各组间无明显差异,其中shNC转染组、shGAPDH转染组神经元ABRAmRNA和蛋白表达较强,shABRA-57转染组、shABRA-371转染组、shABRA-944转染组和shABRA-1015转染组ABRAmRNA和蛋白表达均显著弱于shNC转染组与shGAPDH转染组,以shABRA-371转染组最明显。(4)shABRA-371转染原代海马神经元,沉默ABRA基因后,表达ABRA-shRNA的神经元突起生长呈抑制趋势,突起坍塌和回缩,胞体己开始变形,轴突的长度和突起的总长度及分支点的数目与对照组相比显著减少。结论：(1)ABRA在海马神经元细胞中有表达,与MAP-2共定位在树突中。(2)shRNAs成功的转染入原代培养大鼠海马神经元。(3)成功筛选出一对抑制效果最显著的ABRAmRNAshRNA。(4)shRNA抑制ABRA表达后,神经元突起回缩塌陷,且轴突的长度和突起的总长度及分支点的数目明显减少,说明干扰ABRA后能抑制突起生长,ABRA在神经元突起生长中起重要作用。
【作者】刘丽华；
【导师】蔡维君；邓盘月；
【作者基本信息】中南大学，基础医学，2014，博士
【关键词】ABRA；大鼠；海马；大脑皮质；脊髓；共聚焦免疫荧光术；肌动蛋白；shRNA；突起；生长；神经元；

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